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FastQC est un programme JAVA de control de qualité de données de séquençage. FastQC utilise plusieurs métriques pour évaluer la qualité des séquences. Un rapport (html) est produit à la fin de l'analyse. Ce rapport très simple permet d'identifier les types d'erreurs potentiels au sein des données, donnant ainsi une idée sur leur origine. Le programme peut être exécuté soit en ligne de commande, soit à partir de l'interface graphique.

Pour accéder à l'aide, faitesutiliser :

fastqc --help

fastqc [-o répertoire de sortie] [-f fastq|bam|sam] [-t nombre de threads]  [-c fichier de contaminant] sequence1 sequence2 ... sequenceN

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Au cours de la préparation des librairies de séquençage Illumina, des séquences adaptatrices sont ajoutées de part et d'autres de chaque fragment.  

Fastp

fastp est un outil qui permet d'effectuer à la fois le nettoyage des données Illumina et d'effectuer le contrôle qualité avant et après le nettoyage. 

Trimmomatic

Trimmomatic [1] est un outil pour "trimmer" les données FASTQ d'Illumina et enlever les séquences de faibles qualités, ainsi que celle de l'adaptateur. Il est important de retirer ces séquences avant toute Ces séquences sont toujours présente lors du séquençage et peuvent donc être séquencées et se retrouver dans les jeux de données Illumina. Il est donc important de retirer ces séquences avant toute analyse ultérieure, puisqu'elles risquent de fausser l'assemblage et les résultats des analyses. Par ailleurs

De plus, la méthode de séquencage séquençage par synthèse employée par Illumina peut résulter en une induire certains artéfacts, donc une accumulation d'erreurs aux extrémités des reads [2]. On assiste donc à une variation de la qualité des séquences le long des reads. Grâce à Trimmomatic, les régions de faible qualités peuvent être trimmées, de même que les séquences contaminantes. Trimmomatic est donc l'une des premières étapes pour contrôler la qualité de vos reads.Il est donc nécessaire d'enlever certaines régions aux extrémités des lectures afin de limiter la présence d'erreur dans les séquences puisqu'elles peuvent affecter négativement les analyser en aval. Cette étape est donc l'une des premières étapes pour contrôler la qualité de vos reads.

Fastp

fastp est un outil qui permet d'effectuer à la fois le nettoyage des données Illumina et d'effectuer le contrôle qualité avant et après le nettoyage. Il s'agit d'un outil très rapide capable de détecter automatiquement les adapteurs ainsi que de corriger les artéfacts typique de la technologie de séquençage employée. 

Pour accéder à l'aide, utiliser : 

fastp --help

La commande minimale pour lancer fastp est : 

fastp -i in.R1.fq.gz -I in.R2.fq.gz -o out.R1.fq.gz -O out.R2.fq.gz

Cependant, comme vous pouvez voir, fastp peut aussi être configuré de manière extensive. Vous trouverez donc ci-dessous les principales options de fastp. 

Entrée/sortie : 

• --in1 <in1.fastq> : fichier contenant les lectures forward.
• --in2 <in2.fastq> : fichier contenant les lectures reverse.
• --out1 <out1.fastq> : fichier de sortie des lectures forward nettoyées.
• --out2 <out2.fastq> : fichier de sortie des lectures reverse nettoyées.
• --unpaired1 <unpaired.fastq> : fichiers contenant les lectures non pairées (contient forward et reverse)

Adapteurs :

• --adapter_sequence <sequence> : séquence des adapteurs forward.
• --adapter_sequence_r2 <sequence> : séquence des adapteurs reverse

Nettoyage des lectures de faible qualité 

• --cut_front : activer le nettoyage des lectures de faible qualité
• --cut_window_size <window> : taille de la fenêtre coulissante (sliding window) 
• --cut_mean_quality <quality> : qualité minimale requise pour conserver la séquence 
• --length_required <length> : longueur minimale pour conserver une lecture

Trimmomatic

Trimmomatic est un autre outil pour nettoyer les données FASTQ produite par Illumina. Il permet notamment d'enlever les séquences des adapteurs et de faibles qualités. Le programme est installé sur les serveurs SENS.

Le programme est installé sur les serveurs du M5. Pour accéder à l'aide, utiliser :

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• -threads NTHREADS : nombre de threads à utiliser
• -phred33 | -phred64 : type de score de qualité à utiliser. Il est important de choisir le bon type d'encodage des scores
• -trimlog LOGFILE enregistrer trace dans un fichier.

• ILLUMINACLIP:<Adapter>:<seed mismatches>:<palindrome clip threshold>:<simple clip threshold> Utilisation d'adaptateurs de type Illumina. Ces paramètres sont ceux utilisés pour la détection de la séquence de l'adaptateur. Trimmomatic détecte ces séquences en considérant un seuil (défini par l'utilisateur) pour leur score d'alignement local avec les reads puis en coupant la séquence du reads dans le sens 3'. Il est donc important que les seuils soient assez stringent pour éviter les faux positifs.

  Image Modified

  • <Adapter> : Fichier fasta contenant l'adaptateur
  • <seed mismatches> : Nombre maximum de mismatch pour considérer un alignement valide
  • <palindrome clip threshold> : Précision du match entre deux adaptateurs pour le mode palindrome. Ce mode n'est valide que pour les reads pairés et permet d'identifier la contamination de séquence causée par une extension des reads avec la séquence de l'adaptateur (adapter read-through)
  • <simple clip threshold>: Précision du match entre adaptateur et la séquence du read

• OPTIONS DE TRIMMING : L'ordre des options que vous employez compte.

  • LEADING:<seuil de qualité>: Couper les bases au début de la séquence des reads si leur qualité est inférieure au seuil défini
  • TRAILING:<seuil de qualité>: Couper les bases à la fin de la séquence des reads si leur qualité est inférieure au seuil défini
  • CROP:<longueur> : Couper les reads en enlevant les bases à la fin pour qu'ils aient la longueur spécifiée, peut importe la qualité des bases.
  • HEADCROP:<longueur>: Couper les reads en enlevant le nombre spécifié de base au début de la séquence
  • SLIDINGWINDOW:<Taille de la fenêtre>:<seuil de qualité>: Utiliser une approche de fenêtre coulissante de l'extrémité 5' au 3' pour trimmer les reads. Trimmer dès que la qualité moyenne de la fenêtre descend en dessous d'un seuil défini.
  • MINLEN:<longueur>: Enlever tous les reads dont la taille n'atteint pas la longueur requise
  • AVGQUA:<seuil de qualité>: Enlever le read si sa qualité moyenne est inférieur au seuil défini

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Rcorrector (RNA-seq error CORRECTOR) [3] est un outil de correction des erreurs aléatoires de séquencage au sein des données RNA-seq d'Illumina, qui utilise une approche basée sur les kmers. En effet, les erreurs de séquencage au sein des reads déja très courts, influencent la justesse des analyses ultérieurs effectuées sur ces reads, en particulier l'alignement et l'assemblage). Contrairement aux méthodes de correction des reads WGS (Whole Genome Sequencing) , la correction des reads de données RNA-seq fait face à plusieurs complications, en raison de la variation du niveau d'expression des gènes et de la présence de mécanismes tels que l'épissage alternatif, ce qui heureusement n'est pas le cas dans notre expérience.
Rcorrector utilise un graphe de De Bruijn pour représenter tous les k-mers présents au sein des reads et calcule un seuil local à chaque position du reads, pour chaque k-mer afin de le considérer comme valide ou non. En fonction du seuil défini et du chemin minimisant le nombre d'erreur, Rcorrector corrige les reads de façon adéquate.

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Les k-mers sont déterminés avec JellyFish, un package très rapide, disposant d'une excellente optimisation de la mémoire pour les occurences des k-mers au sein des fragments d'ADN.

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