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Microscope super-résolution Zeiss Elyra PS.1

Pavillon J-A Bombardier, Local 3223-3
Tarif d'utilisation Microscope Avancé tier 2

Instrument octroyé aux Dr Daniel Zenklusen et Pascal Chartrand par la Fondation Canadienne pour l'Innovation (FCI)


Applications Principales

  • Fluorescence
  • Super-résolution:
    • SIM (Structured Illumination Microscopy)
    • PALM/STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
  • TIRF, HiLo
  • Sources lumineuses
    • Lampe Halogène pour la lumière transmise
    • X-Cite Xylis  pour la fluorescence visible (pour la localisation d'échantillons uniquement)
    • Lasers (405/488/561/631) pour la fluorescence

Stabilité des lasers

Pour de l'imagerie quantitative, les lasers doivent être allumés 60 à 90 minutes avant l'acquisition

Laser (nm)

Puissance nominale à la sortie (mW)

Puissance à l'objectif 10x en mW (2024/07/15)

SIM mode

Puissance à l'objectif 10x en mW (2024/07/15)

TIRF mode (WF-EPI)

405

50

2.15

3.6

488

100

5.52

7.7

561

100

7.9

10.3

639

100

2.64

3.2

  • Objectifs
  1. 10x/0.3 Air WD
  2. 63x/1.4 Huile 1.4 WD
  3. Vide
  4. Vide
  5. Vide
  6. Vide
PositionNomMarqueNom completIdentifiantGrossissementOuverture numériqueImmersionTypeDistance de travail (mm)Transmittance
(% [nm])		TechniqueÉpaisseur du couvre-objet (mm)
110x/0.3 AirZeiss10x/0.3 Plan Neo-Fluoar
10x0.3AirPlan NeoFLuar


0.17
263x/1.4Zeiss63x/1.4 Plan Apochromat
63x1.4HuilePlan ApoChromat



BF : Champ clair (Bright-field)
PhC : Contraste de phase


  • Cubes de filtres
  1. Transmitted light
  2. Filter set 77 HE (GFP/Cy3.5/Cy5)
  3. BP420-490 + LP750
  4. LP 570
  5. BP490-520 + LP750
  6. LP640

Position

Nom

Marque

ID

Excitation 

Dichroic 

Emission 

Spectres du filtre

Fluorophore (exemples)

1

Transmitted light

Zeiss







2

Filter Set 77 HE

Zeiss

489077-0000-000

TBP 483 + 564 + 642 (HE)

TFT 506 + 582 + 659 (HE)

TBP 526 + 601 + 688 (HE)

GFP, FITC, Alexa488, Cy3.5, DsRed, Calcium Orange, mCherry, Cy5, Alexa647

3

BP420-490 + LP750

Zeiss







4

LP 570

Zeiss







5

BP490-520 + LP750

Zeiss







6

LP640

Zeiss







  • Détecteurs
  1. TV1 pour PALM/STORM (side port): EMCCD iXon EM+ DU-897D-CS0-#BV-462 d’Andor

    1. Back illuminated, >90% QE; Détection d’un photon à la fois, optimisée pour le visible

    2. 512x512, 16 µm pixels (i.e. 1 pixel = 266 nm2 of the sample when using the 63x Objective and 1x adapter), 35 fps (full chip) à plusieurs centaines de fps

    3. 14 bits; 10, 5, 3 et 1 MHz

    4. Refroidie à -80oC, bruit d’intégration (Readout noise) de 49 e- à 10 MHz ou de 32 e- à 3 MHz

  2. TV2 pour SR-SIM (bottom port) : EMCCD iXon3 DU-885K CSO VP461 d’Andor
    1. QE 50-65% between 400nm and 750nm
    2. Image acquise full chip : 1004x1002, pixel de 8 µm (i.e. 1 pixel = 133 nm2 of the sample when using the 63x Objective and 1x adapter), 31 fps (full chip) à 13 812 fps
    3. Image full chip après traitement SR-SIM : 1904x1900
    4. 14 bits; 35, 27 et 13 MHz
    5. Refroidie à -80oC, bruit d’intégration (Readout noise) de 25 e- à 35 MHz ou de 12 e- à 13 MHz


Allumez l’ordinateur (#1)

Allumez la multiprise d’alimentation du microscope (#2), à droite de l'écran

Utilisez vos identifiants UdM pour vous connecter à Windows

Lors de la première utilisation il est nécessaire d’importer les paramètres du microscope AVANT de démarrer le logiciel. Pour ce faire, suivre les instructions Première Utilisation.

Démarrez le logiciel Zen Black

Lors de la première utilisation, il est nécessaire d’importer dans le logiciel les paramètres spécifiques au microscope. Cette procédure est habituellement réalisée lors de la séance de formation.
Il est cependant également possible de l’utiliser pour réinitialiser le logiciel si celui-ci ne s‘affiche pas correctement par exemple. 

Attention, cette procédure supprimera tous vos protocoles d’expérience et rétablira les paramètres originaux du logiciel.

Si ouvert, fermez le logiciel Zen Black et attendre sa fermeture complète (jusqu’à 30 secondes)

Sur le Bureau ouvrez le dossier Documentation

Double-cliquez sur Settings for Elyra

Cliquez sur Yes

Cliquez sur OK

Un script s'excutera et une fenêtre noire apparaitra brièvement

Vous pouvez ensuite réouvrir le logiciel Zen Black

Cette procédure permet de mettre le microscope dans une configuration sécuritaire et d'effectuer une calibration de la mise au point. À la fin de cette procédure le microscope sera prêt pour l'acquisition.

Sur l’écran tactile du microscope :

Appuyez sur Home>Load Position pour faire descendre la platine dans sa position la plus basse

Appuyez sur Set Work Position pour mémoriser cette position

Si nécessaire, déplacez la mise au point légèrement vers le haut pour supprimer le message « Lower Z limit reached» qui s'affiche sur l'écran tactile

Appuyez sur Home>Microscope>Turret>Objectives>10x pour sélectionner l'objectif 10x

Si demandé, appuyez sur Done pour supprimer l'avertissement de nettoyage de l'objectif à huile

Appuyez sur Home>Microscope>XYZ>Position>Z-Position>Set zero>Auto pour effectuer la calibration de la mise au point

Appuyez sur OK pour lancer la procédure de calibration de la mise au point

Attendre quelques secondes que la calibration soit terminée

Si calibrée, la mise au point est aux alentours de Z=1.7 mm pour l’encart ajustable et Z=2.4 mm pour les encarts simples. La valeur de la position en Z est visible sur l'écran tactile Home>Z-Position

Faire d’abord la calibration en Z avant d'effectuer la première mise au point.

Sur l’écran tactile du microscope :

Appuyez sur Home>Microscope>Turret>Objectives

Appuyez sur 10x pour sélectionner l'objectif 10x

L’objectif 10x est le plus sécuritaire car il possède une grande distance de travail (6.5 mm). L'échantillon apparaitra parfaitement net bien avant que l'objectif ne s'approche de celui-ci. Il est recommandé de toujours faire la première mise au point avec un objectif sécuritaire. Les objectifs sont para-focaux, faire la mise au point avec l'objectif le plus sécuritaire vous permettra ensuite de trouver facilement votre échantillon avec un autre objectif.

Appuyez sur Home>Load Position pour faire descendre la platine dans sa position la plus basse

Appuyez sur Set Work Position pour mémoriser cette position

Si nécessaire, déplacez la mise au point légèrement vers le haut pour supprimer le message « Lower Z limit reached» qui s'affiche sur l'écran tactile

Selectionnez un des 3 encarts disponibles: i) Petri, ii) Lame ou iii) Combo avec ajustement de l’inclinaison

Placez la lame de test dans l'encart avec le couvre-objet vers l'objectif

Toujours utiliser la lame de test pour effectuer la première mise au point.

 

Éteindre le controleur du Piezo

Toujours éteindre le Piezo avant de toucher à l'échantillon.

 

Placer l’encart sur la platine du microscope 

Sur l’ordinateur :

Ouvrez le logiciel Zen Black

Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF visible ou la Fluo visible pour activer la configuration

Ajustez la mise au point avec la molette principale tout en regardant dans les oculaires jusqu'à ce que l'image soit parfaitement nette

Si calibrée, la mise au point est aux alentours de Z=1.7 mm pour l’encart ajustable et Z=2.4 mm pour les encarts simples. La valeur de la position en Z est visible sur l'écran tactile Home>Z-Position

Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l'illumination

Faire d’abord la première mise au point avec l'objectif le plus sécuritaire avant de sélectionner un autre objectif et de poursuivre avec la mise au point secondaire.

Ce microscope ne possède pas d'autres objectifs à air que le 10x. Cependant s'il en avait la procédure serait la suivante::

Après avoir effectué la première mise au point, sur l’écran tactile du microscope :

Appuyez sur Home>Microscope>Turret>Objectives

Appuyez sur l'objectif désiré

Dans le logiciel Zen Black :

Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF visible ou la Fluo visible pour activer la configuration

Ajustez la mise au point avec la molette de précision tout en regardant dans les oculaires jusqu'à ce que l'image soit parfaitement nette

Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l'illumination

Votre échantillon est prêt pour l’acquisition !

Après avoir effectué la première mise au point, sur l’écran tactile du microscope :

Appuyez sur Home>Microscope>Control>Objectives

Appuyez sur l'objectif 63x. Le microscope abaissera automatiquement la platine pour que l'échantillon soit accessible.

L’objectif 63x est le meilleur objectif à huile car il possède le plus grand nombre de corrections optiques (Plan Apochromat) et la plus grande ouverture numérique (1.4). Il offre une résolution latérale de 420nm à une longueur d'onde de 550nm.

 

Retirez votre échantillon

Déposer une goutte d’huile sur l'objectif

Replacez votre échantillon

Appuyez sur Done. Le microscope replacera automatiquement l'échantillon à sa position originale.

Allumez le controlleur du Piezo

Toujours éteindre le Piezo avant de toucher à l'échantillon.

 

Dans le logiciel Zen Black :

Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF visible ou la Fluo visible pour activer la configuration

Ajustez la mise au point avec la molette de précision tout en regardant dans les oculaires jusqu'à ce que l'image soit parfaitement nette

Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l'illumination

Votre échantillon est prêt pour l’acquisition !

Les fichiers peuvent être sauvés temporairement (pendant l’acquisition) sur le disque local C: (bureau)

À la fin de chaque session, copiez vos données sur votre disque externe et supprimez-les du disque local C:

Vous pouvez stocker vos fichiers sur le disque D: (Data Storage). Si vous utilisez ce disque, veuillez créer un dossier par laboratoire en utilisant le nom de famille du chercheur principal. À l’intérieur, créez un dossier par utilisateur (Prénom_Nom).

Dans tous les cas, ne stockez pas vos fichiers sur le disque C:

Enregistrez vos données

Fermez le logiciel Zen Black

Transférez vos données sur le disque D: (Data Storage) ou sur votre disque dur externe et les supprimer du disque local C:

Nettoyez les objectifs à huile avec du nettoyant et du papier à lentille

Éteindre la barre d’alimentation du microscope (#2)

Éteindre l'ordinateur (#1)

Rappels Importants

Récupérez vos échantillons notamment ceux dans le microscope

Laissez le microscope et l’espace de travail propre

Les schémas suivants permettent de suivre le trajet lumineux en lumière transmise (fond clair, contraste de phase) et en lumière réfléchie (fluorescence).
Section disponible dans la version anglaise.

Section disponible dans la version anglaise.

Dépannage

Ce microscope est entièrement motorisé à l'exception de la lampe Xylis pour la fluorescence visible. Assurez vous que la lampe soit allumée en appuyant sur le bouton de la telecomande.

FAQ

Oui. C'est un microscope inversé conçu pour l'observation de spécimen vivant.

Plus de dépannage et de FAQs sont disponibles dans la version anglaise.


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