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Microscope Zeiss LSM-900 Confocal Airyscan

Pavillon Desmarais, Local 2234
Tarif d'utilisation Microscope Avancé tier 2

Instrument octroyé au Dr Jean-Philippe Gratton par la Fondation Canadienne pour l'Innovation (FCI) en 2016

  • Super-resolution Airyscan avec joint deconvolution
  • Confocal à balayage
    • Lumière transmise
    • Champs clair
    • Contraste d’interférences (DIC)
    • Contraste de phase
    • Fluorescence
  • Photomodulation ciblée (FRAP)
  • Incubation
  • Imagerie longue durée (Timelapse)
  • Déconvolution
  • Extended Depth Focus (voir FAQ)

Sources lumineuses

  • Lampe LED pour la lumière transmise

  • Laser 405nm, 488nm, 561nm, 640nm

Émission (nm)

Puissance nominale (mW)

Puissance mesurée (mW)

405

5


488

10

561

10

640

5
  • X-Cite 120LED mini pour la fluorescence visible

Émission (nm)

Peak d'emission

Puissance nominale (mW)

Puissance mesurée (mW)

DAPI

365



GFP

470

mPlum

587

XCite_120LEDmini_Datasheet.pdf

Objectifs

  1. 5x/0.15 Ph1 Air
  2. 10x/0.25 Ph1 Air
  3. 20x/0.80 Air
  4. 40x/0.95 Air
  5. 40x/1.4 Huile
  6. 63x/1.4 Huile

Position

Nom

Marque

Nom complet

Identifiant

Grossissement

Ouverture numérique

Immersion

Type

Distance de travail (mm)

Transmittance

(% [nm])

Applications

Épaisseur lamelle (mm)

1

5x/0.15 Ph1 Air

Zeiss

5x/0.15 Ph1 Air
N-AchroPlan

420931-9911-000

5x

0.15

Air

N-AchroPlan

12.0

Non Disponible

BF, PhC, Fluo

0.17

2

10x/0.25 Ph1 Air

Zeiss

10x/0.25 Ph1 Air
N-AchroPlan

420941-9911-000

10x

0.25

Air


N-AchroPlan

6.5

Non Disponible

BF, PhC, Fluo

0.17

3

20x/0.8 Air 

Zeiss

20x/0.8 Air
Plan-Apochromat

 420650-9901-000

20x

0.8

Air

Plan-Apochromat

0.55 

>90%
[400-800]

BF, DIC, Fluo

0.17

4

 40x/0.95 Air

Zeiss

40x/0.95 Air
Plan-Apochromat

420660-9970-000 

40x

0.95

Air

Plan-Apochromat

 0.25

>80%
[410-820]

 BF, DIC, Fluo

Variable
0.13-0.21

5

 40x/1.4 Huile

Zeiss

40x/1.4 Huile
Plan-Apochromat

420762-9900-000

40x

1.4

Huile

Plan-Apochromat

 0.13

>80%
[500-850]

 BF, DIC, Fluo

0.17

6

63x/1.4 Huile

Zeiss

63x/1.4 Huile
Plan-Apochromat

 420782-9900-799

63x

1.4

Huile

Plan-Apochromat 

 0.19

>80%
[440-710]

 BF, DIC, Fluo, Super-Resolution
Strehl ratio >90%.

0.17

BF: Bright-field
PhC: Contraste de phase
DIC: Interference contrast

Cubes de filtres

  1. GFP
  2. DAPI
  3. mPlum
  4. DIC Analyzer
  5. Vide
  6. Vide

Position

Nom

Marque

Identifiant

Filtre d'excitation 

Miroir dichroïque

Filtre d'émission

Graphique

1

GFP

Filter Set 38

Zeiss000000-1031-346BP 470/40FT 495BP 525/50

2

DAPI
Filter Set 49		Zeiss

488049-9901-000

G 365FT 395BP 445/50

3

mPlum
Filter Set 64 HE		Zeiss489064-0000-000BP 587/25 (HE)FT 605 (HE)BP 647/70 (HE)

4

DIC AnalyzerZeiss424937-9901-000----

5

Vide------

6

Vide

-----

-

Détecteurs

  • 2x Gallium Arsenide Phosphid (GaAsP) Photomultiplier Tube (PMT)
  • 1x détecteur électronique de transmission (ESID)
  • 1x détecteur Airyscan pour objectif 63x

  1. Si ce n’est pas déjà fait, allumer l’ordinateur et se connecter à Windows avec les identifiants UdeM
  2. Retirer la housse anti-poussière du microscope
  3. Activer les commutateurs System (#2) et Components (#3) dans le rack sous le microscope
  4. Activer la clé du laser (#4) dans le rack sous le microscope
  5. Lors de la première utilisation, importer la configuration du microscope dans le logiciel (voir section Première Utilisation)
  6. Lancer Zen

Lors de la première utilisation de l’instrument, il est nécessaire d’importer la configuration du microscope dans le logiciel. Cette procédure est généralement effectuée pendant la séance de formation. Cependant, elle peut aussi être utilisée pour réinitialiser le logiciel s’il ne s’affiche pas correctement, par exemple. L’exécution de cette procédure effacera tous vos protocoles expérimentaux et réinitialisera le logiciel à ses paramètres d’origine (demandez du soutien si vous n’êtes pas certain).

  1. Si Zen est ouvert, fermez-le et attendez qu’il soit complètement arrêté (cela peut prendre jusqu’à 30 secondes)

  2. Sur le Bureau, ouvrez le dossier Softwares

  3. Double-cliquez sur Zen Settings for LSM 900

  4. Un script s’exécutera et une fenêtre noire apparaîtra brièvement

  5. Lorsque le message Settings for Zen have been imported successfully apparaît, cliquez sur OK pour le fermer

  6. Vous pouvez maintenant ouvrir Zen

Lors de cette procédure, vous allez :

  • Mettre le microscope dans une configuration sécurisée

  • Effectuer une calibration

  • Charger votre échantillon

  • Localiser et ajuster la mise au point

Une fois cette procédure terminée, votre échantillon sera prêt pour l’acquisition.

Cette étape est nécessaire pour calibrer le microscope en XY et Z. Effectuer cette calibration réduira considérablement le temps nécessaire pour localiser et mettre au point votre échantillon.

  • Si ce n’est pas déjà fait, sélectionnez l’objectif de plus faible grossissement. Sur l’écran tactile du microscope : Home > Microscope > Control > Objectives > 5x.

  • Dans Zen, une fois lancé, une boîte de dialogue de calibration devrait apparaître. Cliquez simplement sur Calibrate Now.

  • Le microscope abaissera les objectifs, effectuera d’abord une calibration XY, puis une calibration Z, et reviendra ensuite à sa position d’origine.

Une fois calibré, la mise au point se trouve généralement à Z = 1,7 mm pour une lame de microscope.
La position Z peut être visualisée sur l’écran tactile du microscope sous Home > Z-Position, ainsi que dans Zen, dans l’onglet Focus situé sur le côté droit de l’écran.

Le système peut déjà être calibré. Cela peut se produire si un utilisateur précédent a calibré le système et l’a laissé allumé.

Dans Zen, dans l’onglet Focus situé sur le côté droit de l’écran :

  • Cliquez sur Load pour abaisser l’objectif

  • La position Z est indiquée sous Current

  • Si la valeur de la position Z est inférieure à 100 µm, le système est calibré

Sur l’écran tactile du microscope :

  • Abaissez l’objectif en appuyant sur Home > Load Position

  • Appuyez sur Set Work Position pour enregistrer cette position

  • Si nécessaire, ajustez légèrement la mise au point vers le haut pour effacer le message Lower Z Limit Reached affiché sur l’écran tactile

  • La valeur de la position Z est indiquée

  • Si la valeur est inférieure à 0,1 mm, le système est calibré

Dans Zen, dans l’onglet Stage situé sur le côté droit de l’écran :

  • Si ce n’est pas déjà fait, cochez l’option Show All

  • En bas de l’onglet, cliquez sur Calibrate

  • Un message d’avertissement apparaîtra ; cliquez sur Continue

  • Le microscope abaissera les objectifs et effectuera une calibration de la platine XY, puis reviendra à sa position d’origine

Dans Zen, dans l’onglet Focus situé sur le côté droit de l’écran :

  • Si ce n’est pas déjà fait, cochez l’option Show All

  • En bas de l’onglet, cliquez sur Calibrate

  • Un message d’avertissement apparaîtra ; cliquez sur Continue

  • Le microscope effectuera alors une calibration Z, puis reviendra à sa position d’origine

Les calibrations XY et Z sont maintenant terminées.

Sur l’écran tactile du microscope :

  • Naviguez vers Home > Microscope > XYZ > Position > Z-Position > Set Zero > Auto pour effectuer la calibration de la mise au point

  • Appuyez sur OK pour démarrer la procédure de calibration

  • Attendez quelques secondes que la calibration soit terminée

  • Abaissez l’objectif en appuyant sur Home > Load Position

  • Appuyez sur Set Work Position pour enregistrer cette position

  • Si nécessaire, ajustez légèrement la mise au point vers le haut pour effacer le message Lower Z Limit Reached affiché sur l’écran tactile

  • Naviguez vers Home > Microscope > XYZ > Position > XY-Position > Set Zero > Auto pour effectuer une calibration de la platine

  • Appuyez sur OK pour démarrer la procédure de calibration

  • Attendez quelques secondes que la calibration soit terminée

Les calibrations XY et Z sont maintenant terminées.

Dans Zen :

  • Dans la barre de menu, naviguez vers Tools > Options

  • Sélectionnez Startup/Shutdown

  • Sous Stage/Focus Calibration, assurez-vous que Request Stage/Focus Calibration on Startup est coché

  • Cliquez sur OK pour fermer la boîte de dialogue Options


Assurez-vous que la calibration a été effectuée au préalable. La calibration réduira considérablement le temps nécessaire pour localiser et mettre au point votre échantillon.

Sur l’écran tactile du microscope :

  1. Si ce n’est pas déjà fait, sélectionnez l’objectif de plus faible grossissement : Home > Microscope > Control > Objectives > 5x
    L’objectif 5× est le plus sûr à utiliser en raison de sa longue distance de travail (12 mm). L’échantillon apparaîtra parfaitement net bien avant que l’objectif ne s’en approche. Il est recommandé de toujours faire la mise au point en utilisant d’abord les objectifs les plus sûrs. Comme les objectifs sont parafocaux, faire la mise au point avec les objectifs les plus sûrs facilitera la localisation de l’échantillon lors du passage à des objectifs de plus fort grossissement.

  2. Abaissez l’objectif en appuyant sur Home > Load Position

  3. Appuyez sur Set Work Position pour enregistrer cette position

  4. Si nécessaire, ajustez légèrement la mise au point vers le haut pour effacer le message Lower Z Limit Reached affiché sur l’écran tactile

  5. Placez la lame test sur la platine du microscope avec le couvre‑objet tourné vers l’objectif

    L’utilisation d’une lame test réduira considérablement le temps nécessaire pour préparer l’instrument.

  6. Si nécessaire, ajustez la platine pour vous assurer que l’échantillon est centré sous l’objectif

Dans Zen :

  1. Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF ou la fluorescence désirée (DAPI, GFP ou mPlum) pour activer la configuration

  2. Ajustez la mise au point avec la molette principale en regardant à travers les oculaires jusqu’à ce que l’image soit parfaitement nette

  3. Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l’illumination

Une fois calibré, la mise au point se trouve généralement à Z = 1,7 mm pour une lame de microscope.
La position Z peut être visualisée sur l’écran tactile du microscope sous Home > Z-Position, ainsi que dans Zen, dans l’onglet Focus situé sur le côté droit de l’écran.

Faire d’abord la mise au point initiale avec l'objectif le plus sécuritaire avant de passer à des objectifs de plus fort grossissement.

Après avoir effectué la mise au point initiale, sur l’écran tactile du microscope :

  1. Appuyez sur Home > Microscope > Control > Objectives

  2. Appuyez sur 10x, 20x, 40x (0.95) pour sélectionner l’objectif désiré


L’objectif 40× (0,95) Air est le meilleur objectif à air car il possède le plus grand nombre de corrections optiques (Plan Apochromat) et la plus grande ouverture numérique (0,95), mais il offre un champ de vision plus petit.
L’objectif 20× (0,8) offre le meilleur compromis entre résolution et champ de vision.

Il y a deux (2) objectifs 40×, assurez-vous de sélectionner l’objectif 40× Air (0,95).

Dans Zen :

  • Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF ou la fluorescence désirée (DAPI, GFP ou mPlum) pour activer la configuration

  • Ajustez la mise au point avec la molette de précision tout en regardant à travers les oculaires jusqu’à ce que l’image soit parfaitement nette

  • Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l’illumination

Votre échantillon est prêt pour l’acquisition !

Après avoir effectué la mise au point initiale, sur l’écran tactile du microscope :

  • Appuyez sur Home > Microscope > Turret > Objectives

  • Appuyez sur 40× Oil (1,4) ou 63× Oil (1,4) pour sélectionner l’objectif désiré. Le microscope abaissera automatiquement la platine afin que l’échantillon soit accessible.

Les objectifs 40× et 63× à immersion huile offrent la même résolution spatiale car ils ont la même ouverture numérique (1,4).
L’objectif 40× à immersion huile offre un champ de vision plus large et transmet légèrement mieux la lumière au-delà de 700 nm.
L’objectif 63× à immersion huile transmet légèrement mieux la lumière dans le spectre visible (440–710 nm) et possède un ratio de Strehl plus élevé (90 %). Il est particulièrement adapté à l’imagerie super-résolution, bien que son champ de vision soit plus petit.

Il y a deux (2) objectifs 40×, assurez-vous de sélectionner l’objectif 40× Oil (1,40).

  1. Placez une seule goutte d’huile sur l’objectif.
    Appuyez sur Done. Le microscope remettra automatiquement l’objectif à sa position d’origine.

Dans Zen :

  • Dans l’onglet Locate, sélectionnez BF ou la fluorescence désirée (DAPI, GFP ou mPlum) pour activer la configuration

  • Ajustez la mise au point avec la molette de précision tout en regardant à travers les oculaires jusqu’à ce que l’image soit parfaitement nette

  • Dans l’onglet Locate, sélectionnez Off pour éteindre l’illumination

Votre échantillon est prêt pour l’acquisition !

  • Les fichiers peuvent être sauvés temporairement (pendant l’acquisition) sur le disque local C: (bureau)
  • À la fin de chaque session, copiez vos données sur votre disque externe et supprimez-les du disque local C:
  • Vous pouvez stocker vos fichiers sur le disque D: (Data Storage). Si vous utilisez ce disque, veuillez créer un dossier par laboratoire en utilisant le nom de famille du chercheur principal. À l’intérieur, créez un dossier par utilisateur (Prénom_Nom).

Dans tous les cas, ne stockez pas vos fichiers sur le disque C:

  1. Sauvegardez vos données
  2. Fermez le logiciel Zen
  3. Transférez vos données sur le disque D: (Data Storage) ou sur votre disque dur externe et supprimez-les du disque local C:
  4. Si vous avez utilisé des objectifs à immersion, nettoyez-les avec du nettoyant pour lentilles et du papier
  5. Sélectionnez l’objectif 5× et a et remettez les objectifs en position basse (Load position)
  6. Si utilisé, éteindre la multiprise d’alimentation du module d'incubation (#2A) et fermez la bonbonne de CO2 (#2B)
  7. Tournez la clé des lasers (#4) sur Off dans le module à sous le microscope
  8. Éteignez les commutateurs Components (#3) et System (#2) dans le module sous le microscope
  9. Éteignez l'ordinateur
  10. Couvrir l’instrument avec la housse de protection
  • Récupérez vos échantillons notamment ceux dans le microscope
  • Laissez le microscope et l’espace de travail propres

Dépannage

Le soutien technique est gratuit et illimité. Contactez-nous !

FAQ

Oui, mais… Ce microscope dispose d’un module d’incubation pour maintenir la température, l’humidité et l’atmosphère. Cependant, il n’a pas de module permettant de maintenir la mise au point dans le temps. Il est donc possible de perdre la mise au point sur de longues périodes. Vous pouvez toujours utiliser un autofocus logiciel à différents moments, mais soyez conscient de la phototoxicité si vous utilisez la fluorescence.

Oui. C'est un microscope inversé conçu pour l'observation de spécimen en cultures. Les objectifs sont optimisés pour observer au travers de plaque multi-puits à fond de verre. Il est également possible d'observer des échantillons entre lame et lamelles (d'épaisseur 0.17mm). Pour de longs timelapses, soyez conscient de la phototoxicité.

L’Extended Depth of Focus est une méthode permettant d’aplatir une pile Z en ne conservant que l’information pertinente.

Dans Zen :

  • Sélectionnez l’onglet Processing

  • Sélectionnez la méthode Extended Depth of Focus

  • Cliquez sur Apply

  • Attendez que le traitement soit terminé

  • Sauvegardez l’image traitée

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